纤维素降解菌的筛选及酶活力条件优化研究-pg麻将胡了模拟器链接

材料与方法

1.1   菌株材料来源

试验用纤维素降解菌来自实验室前期筛选的菌株s2，经鉴定为木霉菌（trichoderma sp.）。

1.2   培养基

纤维素刚果红培养基：称取羧甲基纤维素钠 2 g、（nh4）2so4 2 g、nacl 0.5 g、k2hpo4 1 g、mgso4·7h2o 0.5 g、刚果红0.4 g、琼脂12 g，加蒸馏水950 ml加热溶解后，用1 mol/l naoh或hcl将ph值调至 7.0，定容至1 000 ml，121 ℃高压灭菌20 min后待用。

lb液体培养基：称取酵母浸粉5 g、胰蛋白胨10 g、nacl 10 g，加蒸馏水950 ml加热溶解后，再用1 mol/l naoh或hcl将ph值调至 7.0，定容至1 000 ml，121 ℃高压灭菌20 min后待用。

羧甲基纤维素钠培养基：称取羧甲基纤维素钠 10 g、蛋白胨 2 g、nacl 0.5 g、k2hpo4 1 g、mgso4 0.5 g、酵母膏0.5 g和琼脂粉10 g，加蒸馏水950 ml加热溶解后，用1 mol/l naoh或hcl将ph值调至 7.0，定容至1 000 ml，121 ℃高压灭菌20 min后待用。

1.3   发酵培养

将纯化后的纤维素降解菌s2接种到培养基中（每250 ml锥形瓶中装有100 ml液体培养基），于35 ℃恒温摇床中175 rpm/min培养48 h。

1.4   试剂配制

3，5-二硝基水杨酸（dns）试剂：称取6.3 g dns加入262 ml 2 mol/l naoh溶液（作为a液）中，另称取182 g酒石酸钾钠加入500 ml蒸馏水中，加热溶解（作为b液）。将a液加入b液后，再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸钠，完全溶解后定容到1 000 ml，贮存于棕色瓶中保存。

1%葡萄糖标准溶液：准确称取烘干后的葡萄糖1 g，加蒸馏水定容到100 ml。

1.5   酶活力的检测

取发酵培养48 h后的发酵液，4 000 rpm/min离心10 min后取上清液作为粗制酶液，经过试验适量稀释。取0.5 ml酶液加入试管中，加入1 ml 1%羧甲基纤维素钠与0.5 ml pbs，于37 ℃水浴30 min后，加入1 ml dns试剂，沸水浴5 min，冷却后加入5 ml蒸馏水，混匀后用分光光度计在540 nm处检测吸光值[10]。

葡萄糖标准曲线的绘制：按表1依次加入各种试剂后，加入0.5 ml灭活后的酶液，其余步骤同上。

酶活力：即为每毫升酶液在此反应条件下1 min内使底物降解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。

1.6   最適条件的优化

最适ph的培养：将s2分别接种到初始ph值为4、5、6、7、8、9、10的液体培养基中，于35 ℃恒温摇床中175 rpm/min培养48 h，检测酶活力。

最适培养温度的检测：在最适ph值的情况下，将s2分别在不同温度下（29 ℃、31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃）恒温摇床中175 rpm/min培养48 h，检测酶活力。

2   结果与分析

2.1   葡萄糖标准曲线的绘制

葡萄糖标准曲线的绘制如图1所示。

由图1可知不同葡萄糖浓度所对应的吸光值（mg/ml），公式为y=0.024x 0.006 66 （r2=0.993 05），后续试验可根据这个标准曲线计算出不同ph值和温度下的葡萄糖浓度，从而计算出酶活力。

2.2   不同初始ph值对s2酶活力的影响

不同初始ph值对s2酶活力的影响如图2所示。

由图2可以看出，纤维素降解菌s2在酸性条件下（ph值=4或5）吸光值均小于0.3，酶活力较低;s2吸光值在ph值=6时吸光值达到最大值0.64，说明此时酶活力最高;而随着初始ph值的增加，吸光值逐步降低，在ph值=10时吸光值达到最小值0.12。

2.3   不同培养温度对s2酶活力的影响

不同培养温度对s2酶活力的影响如图3所示。

由图3可以看出，纤维素降解菌s2在较高和较低温度下吸光值较低，表示酶活力较低;在33 ℃时吸光值达到最大值0.41，说明此时酶活力最高;随着培養温度的增加，吸光值逐步又降低到0.29。说明33 ℃是s2最佳培养温度。

综上所述，纤维素降解菌在降解功能的筛选中根据目的和阶段的不同，应采用不同的培养基;而不同种属的微生物特性不同，表现出的酶活力在不同初始ph值和培养温度下完全不一样。研究表明，细菌和真菌对纤维素的降解机理存在不同，细菌主要通过细胞表面酶进行降解，所以需要附着在纤维素表面进行;而真菌是直接分泌多种细胞外酶进行降解[11]。在本研究中，木霉菌s2对纤维素具有较好的降解效果，同时通过对其培养条件的优化，旨在提高其降解效果[12]。通过试验证明，s2的最佳初始ph值为6，最佳培养温度为33 ℃。

参考文献：

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